Pbpk体外实验系列（四）：药物发现阶段的代谢物鉴定

Xin_FDU · 2026 年8 月 1 日 08:53

一、为什么要尽早开展代谢物鉴定？

药物进入体内后，通常会经过氧化、还原、水解、脱烷基、葡萄糖醛酸结合或硫酸结合等生物转化过程，形成一种或多种代谢物。

因此，仅仅知道一个候选药物“代谢快或代谢慢”通常是不够的，还需要进一步回答：

药物主要生成哪些代谢物？
主要代谢通路是什么？
分子结构中的哪个位置是代谢软点？
代谢物是否仍具有药理活性？
是否形成稳定、可循环的代谢物？
是否形成潜在的反应性或毒性代谢物？
动物与人之间的代谢谱是否一致？
体外体系中生成的代谢物是否也能在体内检测到？
是否需要将某个代谢物单独纳入PK或PBPK模型？

药物发现阶段尽早开展代谢物鉴定，可以帮助药物化学研究人员：

识别分子的主要代谢软点；
通过结构修饰提高代谢稳定性；
降低反应性代谢物形成风险；
解释母体药物PK与药效之间的不一致；
判断是否存在活性代谢物；
比较不同物种的代谢差异；
为后续清除机制、DDI和PBPK建模提供依据。

本章主要参考Wing W. Lam、Jie Chen、Rongfang Fran Xu、Jose Silva和Heng-Keang Lim撰写的《Metabolite Identification in Drug Discovery》。

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二、代谢物鉴定到底要得到什么结果？

代谢物鉴定不是简单地寻找“新峰”，而是需要逐步回答三个层次的问题。

第一层：有没有代谢物？

首先确认某个色谱峰是否为药物相关成分，而不是：

基质内源性成分；
样品处理产生的降解产物；
色谱系统中的污染物；
母体药物的加合离子；
二聚体；
源内碎裂产物；
空白样品中的背景峰。

第二层：发生了什么生物转化？

根据母体药物与代谢物之间的质量差，初步判断可能的代谢反应。

常见质量变化线索包括：

生物转化	常见名义质量变化
单羟基化或单氧化	+16 Da
脱氢	−2 Da
还原或加氢	+2 Da
去甲基化	−14 Da
去乙基化	−28 Da
葡萄糖醛酸结合	+176 Da
硫酸结合	+80 Da
水解	根据断裂基团决定
多步代谢	多个质量变化叠加

质量差只能提示“可能发生了什么反应”，不能单独确定具体结构。

例如，检测到一个比母体药物高16 Da的代谢物，可能包括：

芳香环羟基化；
脂肪链羟基化；
氮氧化；
硫氧化；
其他单氧化反应。

第三层：具体修饰发生在哪里？

这一步通常最困难。

需要综合：

母体药物的MS/MS裂解规律；
代谢物的MS/MS碎片；
特征性中性丢失；
高分辨准确质量；
同位素分布；
色谱保留时间；
合成代谢物对照品；
化学衍生化；
氢氘交换；
化学还原；
NMR等技术。

需要特别强调：

仅依靠一级质谱的分子量变化，通常只能推测代谢反应类型，不能确定准确代谢位点。

三、代谢物鉴定、代谢稳定性和代谢物定量有什么区别？

这三个概念经常被混在一起。

研究类型	核心问题	主要结果
代谢稳定性	母体药物消失得多快？	半衰期、母体剩余比例、内在清除率
代谢物鉴定	母体药物变成了什么？	代谢物结构、代谢通路、代谢软点
代谢物定量	代谢物生成了多少？	浓度、生成速率、AUC、剂量回收比例

一次LC-MS/MS实验可以同时提供部分代谢稳定性和代谢物鉴定信息，但两者关注的分析对象不同：

代谢稳定性主要追踪母体药物；
代谢物鉴定主要寻找和解释新生成的药物相关成分。

如果代谢物没有合成标准品，通常只能进行相对或半定量分析，不能将峰面积直接解释为真实浓度。

四、代谢物鉴定可以使用哪些实验体系？

1. 人肝微粒体

人肝微粒体，human liver microsomes，简称HLM，主要包含位于内质网膜上的酶系统，包括：

CYP酶；
FMO；
UGT；
部分酯酶和其他膜结合酶。

其优点包括：

操作简单；
成本较低；
批次稳定；
适合自动化；
适合高通量筛选；
容易通过补充不同辅因子研究特定代谢通路。

主要局限包括：

缺少胞质酶；
缺少完整细胞膜和转运过程；
缺少完整细胞内辅因子循环；
不能覆盖所有Ⅰ相和Ⅱ相代谢通路；
可能无法形成需要多酶连续作用的代谢物。

2. 肝S9组分

肝S9是肝组织匀浆经低速离心后得到的上清组分，通常同时包含：

微粒体酶；
胞质酶。

与微粒体相比，S9可以覆盖更广泛的代谢酶系统，因此更适合研究：

CYP介导的氧化；
醛氧化酶代谢；
黄嘌呤氧化酶代谢；
部分水解反应；
部分Ⅱ相结合反应。

但S9中的酶浓度相对较低，仍然需要根据目标代谢反应补充适当辅因子。

3. 人原代肝细胞

人原代肝细胞理论上保留了较完整的：

Ⅰ相代谢酶；
Ⅱ相代谢酶；
胞质酶；
细胞摄取和外排过程；
细胞内辅因子循环；
多步连续代谢能力。

因此，肝细胞生成的代谢谱通常比微粒体更接近体内情况。

可使用：

悬浮肝细胞；
贴壁肝细胞；
长期培养或共培养肝细胞。

悬浮肝细胞适合较高通量、较短时间的实验；贴壁或长期培养体系更适合低清除、慢代谢化合物。

肝细胞的局限包括：

供体间差异；
解冻和培养条件会影响酶活性；
表型可能随培养时间改变；
高通量自动化相对复杂；
对于极低清除化合物，仍可能无法在常规时间内生成足量代谢物。

4. 体内生物样品

常见体内代谢物鉴定样品包括：

血浆；
全血；
尿液；
胆汁；
粪便提取物；
肝脏或其他组织；
药效或毒理研究中的残余样品。

体内样品可以回答：

体外观察到的代谢物是否在体内存在；
哪些代谢物可以进入循环；
哪些代谢物主要通过尿液或胆汁排泄；
是否存在仅在特定物种中出现的代谢物；
是否存在体外体系未能生成的代谢物。

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五、如何选择合适的代谢物鉴定体系？

没有一种体外体系能够解决所有代谢问题。

如果主要关注CYP氧化代谢

可以优先使用：

人肝微粒体 + NADPH再生系统

如果怀疑存在UGT代谢

需要考虑：

微粒体 + UDPGA

必要时使用alamethicin对微粒体进行活化，以提高底物进入UGT活性位点的能力。

如果怀疑存在胞质酶代谢

应考虑：

肝S9或完整肝细胞

例如怀疑醛氧化酶参与时，仅使用微粒体可能产生假阴性。

如果需要获得更接近体内的完整代谢谱

优先考虑：

人原代肝细胞

如果化合物代谢非常慢

可以考虑：

延长肝细胞培养时间；
使用贴壁肝细胞；
使用肝细胞共培养体系；
增加初始化合物浓度；
提高样品浓缩倍数；
采用高灵敏度高分辨质谱。

但提高浓度和延长时间也可能带来非生理代谢、细胞毒性或非特异性降解，需要设置相应对照。

六、实验需要哪些主要材料？

1. 生物材料

根据研究目的选择：

新鲜或冷冻保存的人肝细胞；
人、犬、大鼠、小鼠或其他物种肝细胞；
人或动物肝微粒体；
人或动物肝S9；
动物或临床研究中的血浆、尿液、胆汁和组织样品。

2. 缓冲液和辅因子

常用试剂包括：

100 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.4；
EDTA；
MgCl2；
NADPH再生系统；
NAD+；
UDPGA；
PAPS；
GSH；
其他与目标酶相关的辅因子。

不同代谢途径所需辅因子不同。

代谢体系或反应	常用辅因子
CYP氧化	NADPH或NADPH再生系统
UGT葡萄糖醛酸化	UDPGA
磺基转移酶反应	PAPS
部分脱氢酶反应	NAD+或NADP+
反应性代谢物捕获	GSH、半胱氨酸或氰化物等

3. 样品处理试剂

乙腈；
甲醇；
丙酮；
甲酸；
氮气吹干装置；
0.45 μm尼龙过滤膜；
内标；
LC-MS级水和有机溶剂。

4. 分析仪器

液相色谱系统；
三重四极杆质谱；
线性离子阱质谱；
QTrap；
QTOF；
Orbitrap；
LC-UV-MS/MS系统；
数据处理和代谢物预测软件。

七、书中微粒体或S9代谢物鉴定实验怎么做？

以下为书中给出的通用实验框架，主要用于研究CYP介导的体外代谢。

1. 准备缓冲液

使用：

100 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.4

并加入：

5 mM MgCl2
1 mM EDTA

实验前向约100 mL缓冲液中通入氧气约10 min。

2. 配制孵育体系

书中通用孵育条件为：

成分	终浓度
待测化合物	10 μM
肝微粒体蛋白	1 mg/mL
或肝S9蛋白	2 mg/mL
EDTA	1 mM
MgCl2	5 mM
NADP+	1.3 mM
Glucose-6-phosphate	3.3 mM
Glucose-6-phosphate dehydrogenase	0.4 units
总孵育体积	1 mL

以微粒体孵育为例，依次加入：

840 μL磷酸缓冲液
50 μL、20 mg/mL肝微粒体
10 μL、1 mM待测化合物

随后根据实验设计加入辅因子溶液，使最终体积达到1 mL。

3. 预孵育

将微粒体或S9、缓冲液和待测药物混合后：

37 °C预孵育3 min

4. 启动反应

加入NADPH再生系统或其他辅因子启动代谢反应。

如果研究其他代谢通路，可以补充：

3.3 mM NAD+：用于部分S9代谢反应；
UDPGA：用于葡萄糖醛酸化；
GSH：用于捕获部分反应性中间体。

5. 设置阴性对照

至少设置：

无辅因子对照；
无酶对照；
0 min样品；
空白基质；
仅含母体药物的标准样品。

无辅因子对照中，应使用相同体积的缓冲液替代辅因子溶液。

6. 孵育

书中通用条件为：

37 °C孵育60 min

实际研究中，应根据母体药物稳定性和代谢物生成情况优化孵育时间。

7. 终止反应

加入：

5.0 mL丙酮：乙腈 = 1:1

终止液中含：

0.1%甲酸

随后：

涡旋混匀；
4 °C、2,359 ×g离心10 min；
收集上清液；
氮气吹干。

8. 样品复溶

将干燥残渣使用：

250–300 μL初始液相流动相

进行复溶。

随后通过：

0.45 μm尼龙滤膜

在约14,000 ×g条件下离心过滤2 min，再进行LC-MS/MS分析。

八、肝细胞代谢物鉴定的一般流程

本章强调肝细胞能够提供更接近体内的代谢谱，但具体实验条件需要根据细胞类型和研究目的进行优化。

一般流程为：

解冻或制备肝细胞
↓
检测细胞活率
↓
调整细胞密度
↓
加入待测化合物
↓
37 °C孵育
↓
设置多个时间点
↓
加入有机溶剂终止反应
↓
离心去除蛋白和细胞碎片
↓
浓缩样品
↓
LC-MS/MS分析

建议同时设置：

0 min对照；
无细胞对照；
热灭活细胞对照；
溶剂对照；
已知Ⅰ相代谢阳性对照；
已知Ⅱ相代谢阳性对照。

肝细胞一般不需要额外加入NADPH或UDPGA，因为完整细胞可以维持相应辅因子系统。

九、体内血浆样品如何处理？

书中给出的血浆样品处理流程为：

取1.0 mL血浆；
加入5.0 mL预冷的丙酮：乙腈混合液；
丙酮与乙腈比例为1:1；
有机溶剂中加入0.1%甲酸；
涡旋混匀；
4 °C、2,359 ×g离心10 min；
收集上清液；
氮气吹干；
使用250–300 μL初始流动相复溶；
经0.45 μm尼龙滤膜过滤；
进行LC-MS/MS分析。

对于低暴露水平的血浆样品，通常需要较高的样品浓缩倍数。

尿液和胆汁中的药物相关成分浓度可能更高，但其盐离子、胆汁酸和内源性成分也可能产生明显基质干扰。

十、LC-MS/MS如何发现代谢物？

1. 全扫描

首先进行适当质量范围的全扫描，以覆盖：

母体药物；
Ⅰ相代谢物；
Ⅱ相代谢物；
可能的加合离子；
可能的二聚体。

全扫描的优势是覆盖面广，但对于低丰度代谢物，灵敏度可能不足。

2. 数据依赖采集

数据依赖采集，data-dependent acquisition，简称DDA，是本章推荐的主要策略之一。

其基本逻辑为：

一级质谱发现符合条件的离子
↓
自动选择该离子作为前体离子
↓
进行碰撞诱导解离
↓
采集MS/MS碎片
↓
根据碎片推测代谢物结构

触发条件可以包括：

预设质量列表；
同位素模式；
离子强度阈值；
特定中性丢失；
特定前体离子；
质量亏损范围。

实验前可先将少量母体药物直接进样，确认其：

离子化模式；
主要加合离子；
MS/MS裂解特征；
合适碰撞能；
DDA触发条件。

3. 选择离子监测

选择离子监测，selected ion monitoring，简称SIM，适合检测已经预期到的低丰度代谢物。

例如，根据母体药物结构预先生成可能的代谢物质量列表，包括：

母体质量+16；
母体质量−14；
母体质量+176；
母体质量+80。

随后重点监测这些离子。

4. 前体离子扫描

前体离子扫描用于寻找可以产生某个共同特征碎片的代谢物。

例如，如果母体药物及其代谢物均保留某个稳定结构片段，可以扫描所有能够生成该特征碎片的前体离子。

5. 中性丢失扫描

中性丢失扫描适合识别具有共同脱落基团的结合型代谢物。

本章给出的常见中性丢失线索包括：

代谢物类型	常见中性丢失
葡萄糖醛酸结合物	176 Da
硫酸结合物	80 Da
部分GSH加合物	129 Da

需要注意，中性丢失只是筛查线索，仍需要结合准确质量和MS/MS碎片确认。

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十一、如何根据MS/MS碎片定位代谢区域？

假设母体药物经过碰撞裂解后形成三个主要碎片：

Fragment A
Fragment B
Fragment C

如果代谢物比母体药物增加16 Da，并且：

Fragment A同样增加16 Da；
Fragment B和Fragment C不变；

则可以推测氧化反应发生在Fragment A所包含的结构区域。

相反，如果：

母体药物和代谢物的Fragment A完全相同；
Fragment B增加16 Da；

则氧化位置更可能位于Fragment B对应的结构部分。

这种方法通常可以将代谢位点缩小到某个结构区域，但未必能确定到单一原子。

对于位置异构体，可能出现：

相同前体离子质量；
相似MS/MS碎片；
不同色谱保留时间。

此时常常需要合成标准品、NMR或化学衍生化进一步确认。

十二、如何进行代谢物半定量？

1. 为什么代谢物定量比较困难？

在药物发现早期，通常没有代谢物合成标准品。

不同代谢物与母体药物之间可能存在不同的：

电离效率；
碎裂效率；
色谱回收率；
基质效应；
紫外吸收系数。

因此：

不能直接认为代谢物峰面积是母体药物峰面积的20%，就代表代谢物浓度是母体药物浓度的20%。

2. 母体归一化的相对响应

可以计算代谢物与母体药物的峰面积比：

R_{M/P} = \frac{A_M}{A_P}

其中：

A_M：代谢物峰面积；
A_P：母体药物峰面积。

该指标可以用于：

比较不同孵育时间；
比较不同物种；
比较不同候选化合物；
比较不同辅因子条件。

但不能直接解释为真实摩尔浓度比。

3. 药物相关总响应中的相对比例

如果采用相同检测方式，可计算某个代谢物在总药物相关响应中的比例：

f_{M_i,\mathrm{response}} = \frac{ A_{M_i} }{ A_P+\sum_{j=1}^{n}A_{M_j} } \times100\%

该结果应明确表述为：

response-based relative abundance

而不是未经验证的质量平衡比例或摩尔百分比。

4. 使用UV 220 nm进行半定量

本章介绍了一种使用母体药物作为参照，在220 nm通用紫外波长下估计代谢物水平的方法。

基本实验包括：

制备高浓度母体药物微粒体孵育样品；
制备相同浓度的母体药物加标样品；
对两组样品进行相同前处理；
采用LC-UV-MS/MS分析；
比较母体药物和代谢物在220 nm下的峰面积。

代谢物浓度可近似表示为：

C_{M_i} \approx C_{P,\mathrm{ref}} \times \frac{ A_{\mathrm{UV},M_i} }{ A_{\mathrm{UV},P,\mathrm{ref}} }

其中：

C_Mi：代谢物估计浓度；
C_P,ref：母体药物参照浓度；
A_UV,Mi：代谢物220 nm峰面积；
A_UV,P,ref：母体药物参照样品220 nm峰面积。

该方法依赖一个重要假设：

母体药物和代谢物在220 nm下具有相近的摩尔消光系数

因此，该结果仍然属于半定量估计。

5. 最可靠的定量方法

如果某个代谢物具有以下特点：

是主要循环代谢物；
具有药理活性；
具有潜在毒性；
需要用于PBPK建模；
需要进行临床暴露评价；

则应尽可能合成代谢物标准品，并建立独立、经过验证的定量方法。

十三、如何使用高分辨质谱提高鉴定可信度？

高分辨质谱可以获得代谢物的准确质量，并计算质量误差：

\mathrm{Mass\ error}\;(\mathrm{ppm}) = \frac{ m/z_{\mathrm{observed}}-m/z_{\mathrm{theoretical}} }{ m/z_{\mathrm{theoretical}} } \times10^6

准确质量可以帮助：

缩小可能的分子式范围；
区分相近名义质量的化学组成；
排除部分基质干扰峰；
结合元素组成推测代谢反应；
改善代谢物鉴定可信度。

但准确质量相同并不代表结构相同，位置异构体和部分结构异构体仍然可能具有相同分子式。

十四、什么是质量亏损过滤？

质量亏损过滤，mass defect filtering，简称MDF，是从复杂基质中筛选药物相关成分的重要数据挖掘方法。

同一个母体药物形成的多数Ⅰ相和Ⅱ相代谢物，通常仍然保留母体的大部分结构。因此，其质量亏损往往与母体药物相近。

本章介绍的常见思路是：

计算母体药物的准确质量和质量亏损；
设定允许的质量亏损窗口；
保留落在窗口内的离子；
过滤大量不相关的内源性基质离子。

章节中提到，许多Ⅰ相和Ⅱ相代谢物的质量亏损可以落在母体药物约：

±50 mDa

范围内。

但MDF不能单独作为代谢物确证工具，因为：

某些真实代谢物可能超出设定窗口；
某些基质成分也可能落入窗口；
发生较大结构变化的代谢物可能被过滤掉；
多步代谢或裂解代谢物可能与母体质量亏损差异较大。

因此，MDF通常需要与以下方法联合：

空白背景扣除；
同位素模式过滤；
中性丢失扫描；
前体离子扫描；
时间依赖性分析；
MS/MS碎片解释。

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十五、代谢物鉴定软件能做什么？

代谢物鉴定通常涉及大量数据，软件可以自动完成：

空白与孵育样品差异分析；
预测可能的代谢反应；
生成预期代谢物质量列表；
提取离子色谱；
质量亏损过滤；
同位素模式识别；
中性丢失筛查；
母体与代谢物碎片比较；
代谢物峰排序；
输出候选结构和代谢通路图。

本章提到的软件或平台包括：

仪器厂商自带数据处理软件；
Xcalibur；
Mass-MetaSite；
MsXelerator RM；
ACD；
Pallas。

以Mass-MetaSite为例，其基本流程为：

输入母体药物结构；
导入空白基质数据；
导入母体药物标准数据；
导入孵育或体内样品数据；
运行差异分析和结构预测；
查看候选代谢物；
导出表格和报告。

软件可以提高数据处理效率，但最终结构判断仍需要人工检查：

色谱峰形；
对照样品；
准确质量；
同位素模式；
MS/MS碎片；
生物转化合理性。

十六、如何进一步确认官能团和代谢位点？

当MS/MS不能明确区分结构时，可以使用微化学方法进行辅助鉴定。

1. 羧酸或酚羟基的甲基化

本章介绍了使用三甲基硅基重氮甲烷，trimethylsilyldiazomethane，简称TMSD，进行甲基化的方法。

适用于识别：

羧酸代谢物；
酚羟基代谢物。

基本步骤为：

将分离的代谢物样品吹干；
使用0.5 mL乙醚：甲醇=1:1复溶；
加入过量2.0 M TMSD乙醚溶液；
直至溶液呈黄色，说明TMSD过量；
加盖反应1–18 h；
氮气吹干或真空去除过量TMSD；
使用初始流动相复溶；
经0.45 μm尼龙滤膜过滤；
进行LC-MS分析。

羧酸甲基化后通常增加一个甲基，可以通过质量和保留时间变化辅助判断其是否含羧酸基团。

2. TiCl3还原鉴别N-oxide

N-oxide可以被三氯化钛还原回相应胺类，而普通羟基化代谢物在相同条件下通常不会发生相同变化。

如果某个+16 Da代谢物经TiCl3处理后：

原代谢物峰消失；
母体胺类或去氧产物峰增加；

则支持该代谢物为N-oxide。

3. 氢氘交换

氢氘交换，H/D exchange，可以帮助判断代谢物是否含有可交换活泼氢。

如果代谢物含有新生成的羟基，在氘代流动相中可能出现额外的质量变化。

该方法可用于辅助区分：

羟基化代谢物；
N-oxide；
sulfoxide。

4. ESI与APCI对比

某些N-oxide在APCI条件下可能发生热诱导脱氧，而在ESI条件下相对稳定。

可以分别使用：

ESI模式
APCI模式

分析同一样品。

如果+16 Da代谢物在APCI条件下明显转化为去氧产物，可进一步支持N-oxide结构。

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十七、原始数据应该如何整理？

建议将原始结果整理为长数据格式。

Sample_ID	Matrix	Species	System	Time	Cofactor	RT	Precursor_mz	Adduct	Mass_error_ppm	Peak_area	UV_area	Product_ions	Mass_shift	Proposed_pathway	Proposed_site	Confidence
Blank_01	Buffer	Human	HLM	60 min	NADPH	4.21	432.215	[M+H]+	1.8	0	NA	NA	+16	NA	NA	Background
Parent_01	Incubate	Human	HLM	0 min	NADPH	6.82	416.220	[M+H]+	1.2	865000	15230	251, 178	0	Parent	NA	Confirmed
M1_01	Incubate	Human	HLM	60 min	NADPH	4.21	432.215	[M+H]+	1.8	184000	3640	267, 178	+16	Hydroxylation	Region A	Tentative
M2_01	Incubate	Human	Hepatocyte	4 h	None	3.52	592.252	[M+H]+	2.1	96200	2110	416, 251	+176	Glucuronidation	Phenolic OH	Probable

以上仅用于说明数据结构，不是书中真实实验结果。

建议至少保留以下字段：

项目和化合物编号；
母体药物结构版本；
物种；
性别和供体信息；
生物基质；
体外实验体系；
微粒体或S9批次；
肝细胞供体和活率；
化合物名义浓度；
实测浓度；
孵育时间；
蛋白浓度或细胞密度；
辅因子；
终止方式；
样品浓缩倍数；
色谱保留时间；
前体离子质量；
加合离子形式；
电荷状态；
质量误差；
同位素模式；
峰面积；
UV峰面积；
MS/MS碎片；
与母体的质量差；
推测代谢反应；
推测代谢位点；
空白样品中是否存在；
无辅因子对照中是否存在；
相对丰度；
结构鉴定可信度；
是否有标准品确认。

十八、代谢物结构鉴定结果如何分级？

建议在报告中明确区分“确认结构”和“推测结构”。

可以采用以下实用分级：

Level 1：已确认结构

需要具有代谢物标准品，并且：

保留时间一致；
准确质量一致；
MS/MS碎片一致；
必要时具有NMR支持。

Level 2：高度可能结构

没有标准品，但具有：

合理的准确质量；
明确的MS/MS定位证据；
合理的代谢反应；
化学衍生化或其他辅助证据。

Level 3：推测结构或代谢区域

可以确认：

代谢反应类型；
大致修饰区域；

但不能明确具体位置异构体。

Level 4：未知药物相关成分

可以确认该峰可能与药物相关，但：

碎片信息不足；
结构无法解释；
代谢反应类型尚不明确。

在正式报告中，不应将Level 2或Level 3结果表述为“已确认代谢物结构”。

十九、实验中最容易出现哪些问题？

1. 母体药物几乎不发生代谢

如果孵育后母体药物没有明显消失，可能无法生成足够代谢物用于鉴定。

可以考虑：

延长孵育时间；
提高酶蛋白或细胞密度；
使用贴壁或长期培养肝细胞；
增加样品浓缩倍数；
使用更灵敏的质谱；
更换代谢体系；
检查是否缺少必要辅因子。

但不应无限制增加蛋白浓度或孵育时间，否则可能增加：

非特异性结合；
非酶促降解；
辅因子耗竭；
基质干扰；
非生理性代谢通路。

2. 将背景峰误认为代谢物

所有疑似代谢物必须与以下样品比较：

空白基质；
无酶对照；
无细胞对照；
无辅因子对照；
0 min样品。

只有在活性代谢体系中随时间生成或明显增加的信号，才更支持其为真实代谢物。

3. 将源内碎裂误认为代谢物

某些母体药物可能在离子源中发生碎裂，产生一个与真实代谢物质量相同的离子。

判断方法包括：

检查其保留时间是否与母体完全一致；
调低离子源能量；
比较不同离子源条件；
检查是否存在独立色谱峰；
比较真实代谢物MS/MS。

4. 将加合离子或二聚体误认为代谢物

常见加合离子包括：

[M+H]+；
[M+Na]+；
[M+NH4]+；
[M-H]−；
[2M+H]+。

应根据准确质量、同位素分布和保留时间识别这些离子。

5. 代谢物峰面积不能直接代表浓度

不同结构的离子化效率可能相差数倍甚至数十倍。

因此，未经标准品校正的峰面积只能用于：

筛查；
排序；
半定量比较；
时间趋势比较。

不能直接用于计算真实代谢物生成比例、f_m或形成清除率。

6. 只用一种体外体系

仅使用HLM可能遗漏：

胞质代谢；
多步结合代谢；
细胞摄取限制；
转运参与；
需要完整细胞才能形成的代谢物。

对于重要候选化合物，建议结合HLM、S9和人肝细胞结果综合判断。

7. 仅凭+16 Da确定羟基化位置

+16 Da只能提示氧化，不能直接等同于某一确定位置的羟基化。

需要结合：

MS/MS碎片；
保留时间；
化学处理；
标准品；
NMR。

二十、代谢物鉴定如何指导药物结构优化？

如果主要代谢通路为某个局部结构的快速氧化，可以考虑：

增加局部空间位阻；
引入电子效应改变；
使用氟取代；
改变杂环结构；
替换易氧化烷基；
对代谢软点进行氘代；
调整脂溶性；
降低与相关酶活性位点的适配性。

但代谢阻断不一定总是有利。

阻断一个主要代谢通路后，可能出现：

总清除下降；
半衰期延长；
暴露显著升高；
代谢通路转移；
新代谢物出现；
其他酶贡献增加；
反应性代谢通路比例升高。

因此，结构优化后需要重新开展：

代谢稳定性；
代谢物鉴定；
CYP表型；
DDI；
反应性代谢物筛查；
体内PK研究。

二十一、代谢物鉴定结果如何用于PBPK模型？

以下部分是在本章实验基础上的PBPK应用延伸。

1. 代谢物鉴定首先确定模型结构

代谢物鉴定可以帮助确定母体药物和代谢物之间的连接关系。

例如：

Parent → M1
Parent → M2
M1 → M3
M2 → M4

也可能存在：

Parent → M1 → M2

或：

Parent ⇌ M1

如果某个代谢物具有显著系统暴露、药理活性或安全性意义，则应考虑在PBPK模型中将其作为独立化学实体。

2. 代谢物鉴定不能直接提供形成清除率

代谢物鉴定通常只能告诉我们：

形成了什么代谢物；
可能经过什么酶；
在哪些物种或体系中出现；
相对丰度大致如何。

要建立母体-代谢物PBPK模型，还需要进一步测定：

母体药物形成代谢物的内在清除率；
代谢物自身的清除率；
形成途径对应的酶；
代谢途径的f_m；
母体和代谢物的游离比例；
代谢物血浆蛋白结合；
代谢物血细胞分配；
代谢物组织分布；
代谢物肾清除；
代谢物胆汁排泄；
代谢物进一步代谢；
代谢物是否可以回转为母体。

不能直接将LC-MS峰面积比例作为PBPK模型中的f_m。

3. 母体-代谢物模型的一般方程

以母体药物形成一个代谢物为例：

\frac{dA_P}{dt} = \mathrm{Input} - CL_P C_P - CL_{\mathrm{form}}C_P

\frac{dA_M}{dt} = CL_{\mathrm{form}}C_P - CL_M C_M

其中：

A_P：母体药物量；
A_M：代谢物量；
C_P：母体药物浓度；
C_M：代谢物浓度；
CL_P：母体药物除目标形成通路外的清除；
CL_form：母体药物形成代谢物的清除；
CL_M：代谢物自身清除。

代谢物鉴定主要用于确定：

Parent → Metabolite

这一模型连接关系，而不是直接提供上述清除参数。

4. 什么时候必须建立代谢物PBPK模型？

以下情况应重点考虑：

代谢物具有药理活性；
代谢物暴露接近或超过母体药物；
代谢物半衰期明显长于母体；
代谢物可能导致毒性；
代谢物参与DDI；
代谢物主要由多态性酶生成或清除；
肾功能或肝功能可能显著影响代谢物暴露；
动物与人代谢谱差异明显；
临床药效不能由母体药物暴露解释；
需要预测多次给药后的代谢物蓄积。

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二十二、体外代谢谱如何进行体内验证？

体外—体内比较不应只判断“有没有同名代谢物”，还应系统比较：

1. 代谢物是否一致

检查体外和体内样品中是否具有相同的：

准确质量；
色谱保留时间；
MS/MS碎片；
同位素模式。

2. 主要代谢通路是否一致

比较：

HLM中的主要代谢物；
肝细胞中的主要代谢物；
动物血浆、尿液和胆汁中的主要代谢物；
人体样品中的主要循环代谢物。

3. 物种差异

重点关注：

人特异性代谢物；
动物特异性代谢物；
人体中明显高于动物的代谢物；
动物中存在但人体中缺失的代谢物。

4. 相对丰度不能简单直接比较

体外样品与体内样品之间存在明显差异，包括：

药物浓度不同；
作用时间不同；
蛋白结合不同；
组织分布不同；
代谢物进一步清除不同；
尿液和胆汁存在浓缩效应；
不同基质的质谱响应不同。

因此，体外与体内峰面积比例通常只能进行定性或半定量比较。

5. 结果不一致时应检查什么？

如果体外和体内代谢谱不一致，应依次考虑：

体外体系是否缺少相关酶；
是否缺少必要辅因子；
是否存在细胞摄取限制；
是否需要多步连续代谢；
是否存在肠道或肾脏代谢；
是否存在胆汁或尿液中特异性转化；
体外孵育时间是否过短；
代谢物是否在体外进一步快速降解；
分析方法是否遗漏低丰度或高极性代谢物；
代谢物是否因基质效应而未被检出。

二十三、本帖小结

代谢物鉴定主要回答：

药物被代谢成了什么？

而不是仅仅回答：

药物代谢得有多快？

药物发现阶段的代谢物鉴定通常包括：

选择HLM、S9、肝细胞或体内样品；
设置活性体系和阴性对照；
进行体外孵育或收集体内样品；
使用有机溶剂终止反应和沉淀蛋白；
浓缩并复溶样品；
使用LC-MS/MS进行全扫描和数据依赖采集；
通过质量变化发现潜在代谢物；
通过MS/MS碎片推测代谢反应和修饰区域；
使用MDF、背景扣除和同位素过滤降低假阳性；
必要时使用甲基化、TiCl3还原、H/D交换和ESI/APCI对比辅助结构鉴定；
对主要代谢物进行半定量或使用标准品准确定量。

最终可以获得：

主要代谢物清单；
代谢通路图；
代谢软点；
物种差异；
体外—体内一致性；
潜在活性或安全性相关代谢物；
后续酶表型和定量研究方向。

需要注意：

代谢物鉴定本身主要提供代谢通路和结构信息，不能直接给出PBPK模型所需的形成清除率、f_m或代谢物清除率。

对于需要纳入PBPK模型的重要代谢物，还需要进一步开展：

标准品合成；
生物分析方法建立；
代谢物PK研究；
形成动力学研究；
代谢酶表型；
蛋白结合和血细胞分配；
分布与清除研究。

参考资料

Lam WW, Chen J, Xu RF, Silva J, Lim HK. Metabolite Identification in Drug Discovery. In: Caldwell GW, Yan Z, editors. Optimization in Drug Discovery: In Vitro Methods. 2nd ed. Humana Press; 2014.
图由Gemini制作