Pbpk体外实验系列（三）| 人肝细胞cyp诱导实验

定量药理交流 PBPK/PD
1

一、为什么需要评价CYP诱导？

细胞色素P450酶，即Cytochrome P450，简称CYP，是人体药物代谢过程中最重要的酶系统之一。部分药物能够激活肝细胞内的核受体，增加相应CYP酶的转录、表达及代谢活性，这一过程称为CYP诱导。

常见的核受体—CYP对应关系包括：

  • AhR：主要参与CYP1A2诱导；
  • CAR：主要参与CYP2B6诱导；
  • PXR：主要参与CYP3A4，并可影响CYP2B6及部分CYP2C酶。

当一个药物诱导某种CYP酶后，由该酶代谢的药物清除可能加快，暴露量下降，进而导致疗效减弱甚至治疗失败。如果被诱导的代谢通路生成活性或毒性代谢产物，也可能增强药理作用或毒性。

因此，CYP诱导实验主要用于回答以下问题：

  • 待测药物是否会增加特定CYP酶的表达或活性？
  • 这种诱导是否具有浓度依赖性？
  • 诱导作用可能在多大程度上改变自身或合并用药的暴露？
  • 是否需要进一步开展临床药物相互作用研究？
  • 是否需要在PBPK模型中加入酶诱导机制？

本章认为，与核受体报告基因体系或肝癌细胞系相比，分离的人原代肝细胞保留了更完整的酶、转运体和调控机制，是评价体外CYP诱导的重要实验体系。

本帖主要参考Monica Singer、Carlo Sensenhauser和Shannon Dallas撰写的《In Vitro CYP Induction Using Human Hepatocytes》章节。

image
image1024×559 114 KB

图由Gemini制作

二、需要区分的几个核心终点

CYP诱导实验通常从两个层面评价诱导作用：

  1. CYP mRNA表达变化；
  2. CYP酶活性变化。

1. mRNA表达倍数

通过qRT-PCR测定待测组和溶剂对照组的CYP mRNA表达量，计算相对于阴性对照的倍数变化，即fold change，简称FC。

FC_{\mathrm{mRNA}} = \frac{R_{\mathrm{treatment}}} {\overline{R}_{\mathrm{NC}}}

其中：

  • R_treatment：待测组中CYP mRNA与内参RNA的比值；
  • R_NC：阴性对照组中相同比值；
  • NC：negative control，本章中通常为0.1% DMSO溶剂对照。

2. 酶活性倍数

通过加入特异性CYP探针底物，测定相应代谢产物的生成速率，再计算待测组相对于阴性对照组的酶活性倍数。

FC_{\mathrm{activity}} = \frac{v_{\mathrm{treatment}}} {\overline{v}_{\mathrm{NC}}}

其中：

  • v_treatment：待测组的探针代谢产物生成速率；
  • v_NC：阴性对照组的代谢产物生成速率。

3. 相对于阳性对照的诱导百分比

本章将经典诱导剂产生的诱导作用定义为100%，待测药物可表示为阳性对照诱导效应的百分比：

\%\mathrm{PC} = \frac{ FC_{\mathrm{treatment}} - \overline{FC}_{\mathrm{NC}} }{ \overline{FC}_{\mathrm{PC}} - \overline{FC}_{\mathrm{NC}} } \times100\%

其中：

  • PC：positive control，阳性诱导对照；
  • NC：negative control，阴性或溶剂对照。

该指标可用于比较待测药物与已知强诱导剂之间的相对诱导能力。

三、本章主要评价哪些CYP酶？

本章重点介绍以下CYP酶：

CYP酶 主要调控受体 本章阳性诱导剂 阳性诱导剂终浓度
CYP1A2 AhR β-Naphthoflavone 50 μM
CYP2B6 CAR/PXR Phenobarbital 1 mM
CYP2C9 PXR等 Rifampicin 10 μM
CYP2C19 PXR等 Rifampicin 10 μM
CYP3A4 PXR Rifampicin 10 μM

本章指出，CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4是常规诱导评价的主要酶型，CYP2C9和CYP2C19在章节中一并介绍，但通常并非所有项目都会常规开展。

需要注意，以上浓度是本章采用的实验条件，不应直接视为所有实验室的通用固定条件。不同肝细胞供体和实验体系应通过阳性对照预验证诱导能力。

四、实验方法概述

本章采用贴壁培养的人原代肝细胞进行CYP诱导实验，可使用：

  • 冷冻保存的人肝细胞；
  • 新鲜分离的人肝细胞；
  • 已经预先铺板的商业化人肝细胞。

整体实验流程为：

人原代肝细胞复苏或接收
↓
细胞计数和活率评价
↓
接种至胶原包被96孔板
↓
培养48 h，使基础CYP水平趋于稳定
↓
加入待测药物、阳性诱导剂或溶剂对照
↓
孵育24 h
↓
取培养液评价细胞毒性
↓
更换新鲜含药培养基，继续孵育24 h
↓
总诱导时间48 h
↓
加入CYP探针底物测定酶活性
↓
提取RNA测定CYP mRNA
↓
计算FC、%PC及浓度-效应关系

肝细胞在培养初期会迅速去分化，部分CYP基础表达水平下降。本章选择在接种后48 h开始给药，是为了等待CYP基础水平相对稳定后再观察诱导作用。

image
image1024×559 113 KB

图由Gemini制作

五、人肝细胞如何准备？

1. 冷冻肝细胞复苏

复苏后使用台盼蓝进行细胞计数和活率评价。

细胞活率可计算为：

\mathrm{Viability}(\%) = \frac{N_{\mathrm{viable}}} {N_{\mathrm{total}}} \times100\%

其中：

  • N_viable：存活细胞数；
  • N_total：总细胞数。

本章建议，如果复苏后细胞活率低于75%，或存在较多细胞碎片，可考虑使用Percoll梯度进一步纯化；但更推荐在正式实验前预先验证肝细胞供体和批次。

2. 细胞接种

本章将细胞悬液调整至：0.5–0.6 × 10^6 cells/mL

向胶原包被的96孔板中每孔加入：100 μL细胞悬液

因此，每孔约接种：5–6 × 10^4个细胞

接种后在37 °C、CO₂培养箱中培养4–6 h，使细胞贴壁，随后更换为完全Williams’ E培养基。第1天再次更换新鲜培养基。

3. 培养基

本章使用补充了以下成分的Williams’ E培养基：

  • 青霉素/链霉素；
  • 非必需氨基酸；
  • 胰岛素-转铁蛋白-硒；
  • 碳酸氢钠；
  • 100 nM地塞米松。

培养基pH调节至7.4，并在使用前预热至37 °C。

六、待测药物如何进行诱导处理？

1. 待测浓度

待测药物通常以DMSO配制成储备液，再用培养基稀释至实验浓度。

本章建议：

  • 储备液约为最终浓度的1000倍；
  • 所有组最终DMSO浓度保持为0.1%；
  • 每个浓度和每种CYP酶设置3个平行孔；
  • 每种CYP均设置相应溶剂对照和阳性诱导对照。

如果待测药物不能溶解于DMSO，可使用甲醇或乙醇，但终浓度仍不应超过0.1%，并需要为不同溶剂分别设置溶剂对照。

过高的有机溶剂浓度本身可能抑制CYP活性，干扰结果解释。

2. 诱导孵育

Day 2第一次给药：

  • 每孔加入100 μL含待测药物、阳性诱导剂或溶剂的培养基；
  • 每种条件设置3个平行孔。

孵育24 h后：

  • 每孔取10 μL培养液进行LDH细胞毒性检测；
  • 移除剩余培养液；
  • 使用新鲜配制的药物或对照培养基再次给药；
  • 再孵育24 h。

总诱导时间为48 h。

七、为什么必须同步评价细胞毒性？

如果待测药物造成明显肝细胞死亡，CYP mRNA和酶活性均可能下降，或者剩余细胞出现应激反应。这种情况下，观察到的变化不能简单解释为真正的CYP诱导或非诱导。

本章使用LDH释放评价24 h细胞毒性：

  • 溶剂对照：0.1% DMSO；
  • 细胞毒性阳性对照：2% Triton X-100；
  • 检测波长：490 nm；
  • 690 nm作为校正波长。

除LDH外，本章还提到可以采用：

  • ATP含量；
  • MTT；
  • Resorufin或类似活力检测方法；
  • 细胞形态观察。

实验结果解释时，应首先排除明显细胞毒性的浓度。

八、如何测定CYP酶活性？

诱导处理结束后，通过加入CYP特异性探针底物，测定相应代谢产物的生成速率。

本章采用的探针底物和代谢产物如下：

CYP酶 探针底物 测定代谢产物
CYP1A2 Phenacetin Acetaminophen
CYP2B6 Bupropion Hydroxybupropion
CYP2C9 Tolbutamide Hydroxytolbutamide
CYP2C19 S-(+)-Mephenytoin 4-Hydroxymephenytoin
CYP3A4 Testosterone 6β-Hydroxytestosterone

本章的操作条件为：

  • 探针底物终浓度：200 μM；
  • 37 °C孵育；
  • 孵育时间：45 min；
  • 取80 μL培养液；
  • 使用LC-MS/MS测定代谢产物。

不同CYP酶的样品可以单独分析，也可以合并后进行cocktail LC-MS/MS分析。

需要强调，这些底物浓度和孵育时间是本章所用条件。正式实验中，应预先验证：

  • 代谢产物生成与时间呈线性；
  • 代谢产物生成与细胞数呈线性；
  • 底物浓度不会成为限速因素；
  • 探针底物之间不存在明显相互干扰。

1. 代谢产物生成速率

v = \frac{C_M\times V} {t\times N}

其中：

  • C_M：代谢产物浓度；
  • V：孵育液体积；
  • t：探针底物孵育时间；
  • N：肝细胞数，以百万个细胞为单位。

常用单位为：pmol/min/10^6 cells

本章采用12点标准曲线和5个QC水平进行LC-MS/MS定量，标准曲线使用1/x加权线性回归，要求决定系数大于0.99。

image
image1232×1007 121 KB

图源自书本P246

九、如何测定CYP mRNA？

完成探针底物孵育并取样后，清洗肝细胞，加入裂解液提取总RNA，再采用TaqMan qRT-PCR测定CYP基因表达。

本章检测：

  • CYP1A2；
  • CYP2B6；
  • CYP2C9；
  • CYP2C19；
  • CYP3A4；
  • 18S作为内参。

每种探针均建立独立RNA标准曲线，标准曲线为平均Ct值与RNA浓度对数之间的关系。

1. 由标准曲线计算相对RNA量

如果标准曲线为：

C_t = a\log_{10}(RNA)+b

则相对RNA量为：

RNA = 10^{\frac{C_t-b}{a}}

其中：

  • Ct：PCR循环阈值；
  • a：标准曲线斜率；
  • b：标准曲线截距。

2. 内参标准化

R = \frac{RNA_{\mathrm{CYP}}} {RNA_{\mathrm{18S}}}

3. 计算相对于阴性对照的倍数变化

FC_{\mathrm{mRNA}} = \frac{R_{\mathrm{treatment}}} {\overline{R}_{\mathrm{NC}}}

4. 计算相对于阳性对照的诱导百分比

\%\mathrm{PC} = \frac{ FC_{\mathrm{treatment}} - \overline{FC}_{\mathrm{NC}} }{ \overline{FC}_{\mathrm{PC}} - \overline{FC}_{\mathrm{NC}} } \times100\%

本章采用标准曲线法计算相对RNA量，而不是直接使用常见的 2−ΔΔCt2^{-\Delta\Delta Ct}2−ΔΔCt 方法。

十、原始数据应该长什么样？

CYP诱导实验通常至少包括三类原始数据：

  1. 细胞毒性数据；
  2. CYP酶活性数据；
  3. CYP mRNA数据。

1. 酶活性原始数据

建议整理为：

Donor CYP Treatment Concentration Replicate Metabolite concentration Incubation time Cell number Formation rate FC %PC Cytotoxicity
Donor 1 CYP3A4 Vehicle 0 1 1.25 μM 45 min 0.055 million 303 1.00 0 No
Donor 1 CYP3A4 Rifampicin 10 μM 1 8.60 μM 45 min 0.055 million 2085 6.88 100 No
Donor 1 CYP3A4 Test A 1 μM 1 2.10 μM 45 min 0.055 million 509 1.68 12 No
Donor 1 CYP3A4 Test A 10 μM 1 4.20 μM 45 min 0.055 million 1018 3.36 42 No

以上数值仅用于说明数据结构，并非书中真实结果。

2. mRNA原始数据

Donor CYP Treatment Concentration Replicate Ct CYP Ct 18S RNA CYP RNA 18S CYP/18S ratio FC %PC
Donor 1 CYP3A4 Vehicle 0 1 27.1 13.5 0.48 42.6 0.0113 1.00 0
Donor 1 CYP3A4 Rifampicin 10 μM 1 23.8 13.4 4.82 43.1 0.1118 9.89 100
Donor 1 CYP3A4 Test A 1 μM 1 26.0 13.6 1.05 41.9 0.0251 2.22 14
Donor 1 CYP3A4 Test A 10 μM 1 24.9 13.5 2.28 42.5 0.0536 4.74 42

建议至少保留以下变量：

  • 肝细胞供体编号；
  • 新鲜或冷冻细胞；
  • 细胞批次；
  • 复苏后活率；
  • 接种密度；
  • CYP酶型；
  • 待测药物名称；
  • 名义浓度；
  • 实测培养液浓度；
  • 孵育时间；
  • 平行孔；
  • LDH或其他细胞毒性指标；
  • 代谢产物峰面积；
  • 内标峰面积；
  • 反算代谢产物浓度；
  • 代谢产物生成速率；
  • CYP Ct；
  • 18S Ct；
  • FC；
  • %PC；
  • 是否发生沉淀；
  • 细胞形态是否异常。

十一、如何判断是否存在CYP诱导？

本章提出的基础判读框架为：

  • 相对于阴性对照增加至少2倍；
  • 或达到阳性诱导对照效应的20%以上；
  • 且变化具有浓度依赖性。

不同肝细胞供体的结果应分别展示，不应只合并计算一个平均值。对于风险判断，可以重点关注诱导程度最大的供体，即相对保守的最差情形。

需要说明的是，这些标准来自本章所引用的当时监管框架，适合用于理解本章方法，不应直接替代项目开展时适用的现行监管指南和实验室预设标准。

1. mRNA和酶活性均增加

如果mRNA和酶活性均呈浓度依赖性升高，通常可以较明确地支持CYP诱导。

2. mRNA增加，但酶活性不增加

可能原因包括：

  • 待测药物同时抑制该CYP酶；
  • 新合成酶蛋白尚未完全转化为可测活性；
  • 探针底物实验受到待测药物残留干扰；
  • 细胞毒性或非特异性作用；
  • mRNA变化尚未传递至蛋白和功能水平。

本章特别指出，如果mRNA明显升高，但酶活性未增加，应考虑待测药物是否同时具有CYP抑制作用，从而掩盖了诱导后的活性升高。

3. 酶活性增加，但mRNA变化较弱

可能与：

  • mRNA检测时间点不合适；
  • 酶蛋白稳定性变化；
  • 基础表达较低导致测量波动；
  • 实验或分析误差；

有关，需要结合阳性对照、重复实验和供体结果判断。

十二、实验中最容易出现的问题

1. 肝细胞供体差异

不同供体的：

  • 基础CYP表达；
  • 核受体表达；
  • 诱导响应；
  • 细胞贴壁能力；
  • 复苏后活率；

可能存在明显差异。

因此，正式实验前应使用经典诱导剂验证每个供体对目标CYP酶的诱导能力。

2. 细胞在换液时干燥

人原代肝细胞对短暂失去培养液非常敏感。移除培养液时不应一次处理过多孔，本章建议每次最多处理96孔板中的三列或三行，以避免细胞干燥死亡。

3. 名义浓度不等于实际暴露浓度

待测药物可能发生：

  • 非特异性吸附；
  • 培养液中降解；
  • 被肝细胞快速代谢；
  • 细胞内溶酶体蓄积；
  • 沉淀；
  • 蛋白结合。

此时以名义浓度建立浓度-效应关系，可能高估肝细胞实际暴露，导致假阴性或错误的PBPK参数。

本章建议，对于代谢较快或可能发生明显蓄积的药物，可在诱导最后一天测定培养液中的实际药物浓度。

4. 细胞毒性被误认为无诱导

高浓度待测药物可能引起细胞损伤，使CYP表达或活性下降。出现高浓度效应下降时，应首先检查：

  • LDH；
  • ATP；
  • 细胞形态；
  • 实际药物溶解性；
  • 沉淀情况。

5. 同时存在诱导和抑制

待测药物可能一方面增加CYP表达，另一方面直接抑制CYP酶活性。

这种情况下：

  • mRNA结果可能显示阳性；
  • 酶活性结果可能接近阴性或下降。

需要进一步开展可逆抑制或时间依赖性抑制实验。

十三、如何获得PBPK模型需要的参数？

以下部分是在本章实验内容基础上的PBPK应用整理。

本章的基础实验通常使用少量浓度进行风险筛选。如果发现明显诱导作用，可进一步使用至少8个浓度建立完整的浓度-效应关系，估计：

  • Emax⁡​：最大诱导效应；
  • EC50​：达到最大诱导效应50%所需浓度。

一种常见的Emax模型为：

E(C) = 1+ \frac{ E_{\max}\times C }{ EC_{50}+C }

其中：

  • E(C)：特定浓度下相对于基础水平的酶表达或活性倍数；
  • Emax：相对于基础水平的最大额外诱导效应；
  • EC50：产生一半最大效应的浓度；
  • C：驱动诱导的药物浓度。

需要注意，上式是PBPK-DDI建模中常见的后续描述方式，并不是本章直接给出的拟合公式。本章明确提出，可通过至少8个浓度获得 Emax和 EC50​，再用于RIS方法、静态模型或PBPK模型。

1. PBPK中的酶周转

在机制性PBPK模型中，酶量不会在给药后瞬间达到新水平，而是受到酶合成和降解共同控制。

可使用类似以下的酶周转模型：

\frac{dE}{dt} = k_{\mathrm{deg}} \left[ 1+ \frac{ E_{\max}\times C }{ EC_{50}+C } - E \right]

其中：

  • E：相对于基础水平的酶量；
  • kdeg：酶降解速率常数；
  • C：肝细胞内或肝脏作用部位的药物浓度。

该模型可以描述：

  • 连续给药后诱导逐渐增强；
  • 停药后酶水平逐渐恢复；
  • 诱导剂对底物药物AUC和清除率的动态影响。

2. 应使用什么浓度驱动诱导？

理想情况下，PBPK模型应使用作用部位的游离药物浓度，而不是简单使用培养液名义总浓度。

如果药物存在明显的：

  • 非特异性结合；
  • 培养液蛋白结合；
  • 细胞摄取；
  • 细胞内蓄积；
  • 快速代谢；

则需要考虑使用实际测得的培养液浓度、游离浓度或细胞内浓度建立 Emax​-EC50关系。

image
image1024×559 104 KB

十四、体外结果能否直接代表临床CYP诱导？

人原代肝细胞比单纯核受体报告基因系统更接近人体肝脏，但体外结果仍不能直接等同于临床诱导程度。

体外到体内转化受到以下因素影响：

  • 肝细胞供体差异；
  • 体外培养导致的去分化；
  • 名义浓度与实际浓度差异；
  • 肝脏内游离药物浓度；
  • 药物及代谢物的肝细胞摄取；
  • 给药频率和治疗持续时间；
  • CYP酶降解速率；
  • 药物是否同时抑制同一CYP；
  • 诱导剂是否同时影响转运体；
  • 临床底物药物对该CYP的代谢贡献比例。

例如，一个药物可以同时：

  • 诱导CYP3A4；
  • 抑制OATP1B1；
  • 抑制或诱导其他CYP；
  • 生成具有诱导能力的代谢物。

因此，临床净效应需要将多种机制放入PBPK模型中综合评价，而不能只根据单一体外fold change判断。

验证时可以比较：

  • 临床底物药物AUC比；
  • Cmax比；
  • 清除率变化；
  • 多次给药后效应出现时间；
  • 停药后恢复时间；
  • 不同底物药物和不同给药方案下的预测能力。

十五、本帖小结

人原代肝细胞CYP诱导实验主要用于回答以下问题：

第一，待测药物是否增加CYP1A2、CYP2B6或CYP3A4等酶的表达和活性？

第二，诱导作用是否具有浓度依赖性，并达到阳性诱导剂的一定比例？

第三，该诱导作用是否可能降低自身或合并用药的体内暴露？

本章采用贴壁人原代肝细胞进行48 h诱导处理，并通过两类终点评价结果：

  • qRT-PCR测定CYP mRNA；
  • 探针底物和LC-MS/MS测定CYP酶活性。

实验解释时需要同时考虑：

  • 细胞毒性；
  • 肝细胞供体差异；
  • 实际药物暴露浓度；
  • 非特异性结合；
  • 药物代谢损失；
  • 同时存在的CYP抑制作用。

基础筛选结果通常以fold change和相对于阳性对照的诱导百分比表示。对于明确阳性的药物，可进一步通过多浓度实验估计 Emax⁡ 和 EC50​，并与酶周转参数共同用于PBPK-DDI模型，预测临床底物药物暴露的动态变化。

参考资料

Singer M, Sensenhauser C, Dallas S. In Vitro CYP Induction Using Human Hepatocytes. In: Caldwell GW, Yan Z, editors. Optimization in Drug Discovery: In Vitro Methods. 2nd ed. Humana Press; 2014.